После окончательного вхождения псковских земель в состав Русского централизованного государства Изборская крепость еще в течение столетия продолжала играть важную роль, защищая северо-западные рубежи. С середины XVI в. роль форпоста взял на себя расположенный у самой границы Псково-Печерский монастырь.

Во времена Ивана Грозного крепость ждали тяжелые испытания. В январе 1569 г. произошла так называемая «изборская измена». Литовские воеводы, как пишет С. Соловьев, «овладели нечаянно Изборском». Русские изменники Тимоха Тетерин и Марк Сарыхозин переоделись опричниками и повелели страже ночью открыть ворота и впустить их. Царю пришлось освобождать захваченную литовцами крепость. После чего он жестоко расправился с заподозренными в литовской «измене» боярами и стал считать ненадежным население Псковской и Новгородской земель.

В 1581 г. Изборск был взят войсками Стефана Батория, но в следующем году поляки возвратили его. В годы «лихолетья» - Смутного времени - крепость устояла перед войсками Александра Лисовского, а после Северной войны утратила военное значение.